一、方案目的

建立抗感冒颗粒的质量标准。

二、方案概述

方法采用薄层色谱法对处方中黄芩、甘草、桔梗进行鉴别；用高效液相色谱法测定制剂中黄芩苷的含量。采用AichromBond-AQ-C18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm)；流动相：甲醇-水－磷酸(43∶57∶0.2)；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：280nm；进样量：10μL。结果薄层色谱专属性强；黄芩苷的线性范围为0.0496～0.2976μg,r＝0.9997,平均加样回收率为101.80%,RSD＝1.86%(n＝6)。结论该方法简便、准确,重现性好,可作为抗感冒颗粒的质量控制标准。

三、抗感冒颗粒

抗感冒颗粒处方由金银花、连翘、黄芩等9味药材组成。用于风热感冒,发热恶风,鼻塞头痛,咽喉肿痛。

四、仪器与试药

LC-10ADVP高效液相色谱仪,SPD-10AVP紫外检测器,HW色谱工作站，电子分析天平

黄芩药材、黄芩苷、甲醇、乙醇等试剂

五、定性鉴别

1 黄芩薄层色谱鉴别

取黄芩苷对照品,加甲醇制成每1mL含1mg的溶液,作为对照品溶液。取本品10g,加甲醇30mL,超声处理30min,滤过,滤液蒸干,残渣加水5mL,加热使溶解,趁热滤过,滤液用盐酸调节pH值至1～2,摇匀,80℃保温30min,放冷,离心15min,残渣加甲醇0.5mL使溶解,作为供试品溶液[1]。取除黄芩以外的其它8味药材按处方比例制得阴性样品10g,用与供试品溶液相同的方法制得阴性对照液。

吸取上述3种溶液各10μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以1%三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,而阴性对照液无此斑点。

2 甘草薄层色谱鉴别

取甘草对照药材5g,加盐酸1mL及石油醚(60～90℃)25mL,加热回流1h,滤过,滤液挥干,残渣加石油醚(60～90℃)1mL使溶解,作为对照药材溶液[2]。取本品15g,加盐酸2mL及石油醚(60～90℃)40mL,用与对照药材溶液相同的方法制得供试品溶液。取除甘草以外的其它8味药材按处方比例制得的阴性样品15g,用与供试品溶液相同的方法制得阴性对照液。

吸取上述3种溶液各10μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60～90℃)-甲苯-乙酸乙酯-冰乙酸(10∶20∶7∶0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%的磷钼酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应位置上,显相同颜色的斑点,而阴性对照液无此斑点。

3 桔梗薄层色谱鉴别

取桔梗对照药材5g,加7%的硫酸乙醇-水(1∶3)混合液25mL,加热回流1h,放冷,用三氯甲烷提取2次,每次20mL,合并三氯甲烷液,蒸干,残渣加甲醇1mL使溶解,作为对照药材溶液。取本品15g,加7%的硫酸乙醇-水(1∶3)混合液40mL,用与对照药材溶液相同的方法制得供试品溶液。取除桔梗以外的其它8味药材按处方比例制得的阴性样品15g,用与供试品溶液相同的方法制得阴性对照液。

吸取上述3种溶液各10μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-乙醚(1∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,而阴性对照液无此斑点。

六、含量测定

本方中黄芩用量较大,且其中含有的黄芩苷化学性质稳定,测定方法简便,故在含量测定时选择黄芩苷为指标。

1色谱条件

AichromBond-AQ-C18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm)；流动相：甲醇-水-磷酸(43∶57∶0.2),流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：280nm；进样量：10μL。

2对照品溶液的制备

精密称取在五氧化二磷干燥器中真空干燥至恒重的黄芩苷对照品,加甲醇制成每1mL含0.496mg的溶液,摇匀,作为母液。从中吸取5mL,用甲醇稀释至50mL,制成每毫升含0.0496mg黄芩苷溶液,备用。

3供试品溶液的制备

取10个批号的抗感冒颗粒,每批取2份,研细,每份各取0.2g,精密称定,置具塞三角烧瓶中,精密加入甲醇10mL,称定重量,超声处理30min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

4系统适应性考察

分别精密吸取黄芩苷对照液和各供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪。理论塔板数以黄芩苷峰计,不低于2500,此时,黄芩苷峰与其它相邻峰基线分离,分离度R>1.5,保留时间约为14min。

5线性关系的考察

分别精密吸取浓度为0.0496mg/mL黄芩苷对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、6.0mL定容至10mL量瓶中,摇匀,制成4.96、9.92、14.88、19.84、29.76μg/mL的系列溶液。

精密吸取5个不同浓度的对照液各10μL,注入液相色谱仪,各进2针。以浓度C为横坐标,以黄芩苷平均峰面积Y为纵坐标进行线性回归,得回归方程：C＝2×10-4A＋0.7879,r＝0.9997,线性范围为0.0496～0.2976μg。

6精密度试验

精密吸取浓度为9.92μg/mL对照品溶液10μL,连续进样5次,测得黄芩苷峰面积值RSD＝2.48%。

7稳定性试验

精密吸取批号为050705的第一个供试液10μL,每间隔2h进一针,连续考察10h,结果黄芩苷峰面积值的RSD＝2.76%,表明在10h内基本稳定。

8专属性试验

在与样品测定完全相同的条件下,精密吸取黄芩阴性对照液10μL,注入液相色谱仪,连续进3针,阴性无干扰。说明在抗感冒颗粒中,黄芩苷的专属性较强。

9重复性试验

取同一批号(050705)样品0.25g,共6份,精密称定,按样品测定项下的方法测定,测得样品中指标成分黄芩苷的含量,RSD＝2.12%,结果表明重复性良好。

10加样回收率试验

取批号为050705的抗感冒颗粒0.25g,精密称定6份,各精密加入浓度为29.76μg/mL的黄芩苷对照液2.5mL,分别用与“3.3”项下相同的方法制得供试液。并用与“3.11”项下相同的方法测得样品中指标成分黄芩苷的含量。

11样品测定

精密吸取各供试液10μL,注入液相色谱仪,分别进2针。采用标准曲线法定量,根据取样量和稀释度,计算含量。

　　由实验结果可知,仪器的精密度、指标成分的稳定性、方法的重现性和加样回收率等均较好,符合定量要求。根据以上测定结果,暂定每1g抗感冒颗粒中含黄芩以黄芩苷(C21H18O11)计,不得少于0.49mg。

七、结论

上述实验中,黄芩、甘草、桔梗的鉴别专属性强,重现性好,操作简便,故正式纳入抗感冒颗粒质量标准中；而荆芥、板蓝根的鉴别,因阴性有干扰,专属性不强,故未纳入质量标准中。