一、方法原理
样品经高氯酸提取,固相萃取、纯化、浓缩,微孔滤膜过滤后,直接进样。用反相色谱分离,紫外检测器检测,外标法定量。出峰顺序为土霉素、四环素、金霉素。
二、主要仪器设备
三、试剂
- 乙腈:色谱级
- 磷酸二氢钠溶液:0.01mol/L,pH=2.5
- 土霉素、四环素、金霉素标准储备液:土霉素、四环素1mg/mL,金霉素1mg/mL,甲醇为溶剂
- 土霉素、四环素、金霉素混合标准使用液:土霉素、四环素0.05~1μg/mL,金霉素0.2~2μg/mL,流动相为溶剂
- 高氯酸溶液:1%和0.5%
- 甲醇:分析纯
- 乙二胺四乙酸二钠溶液:5%
- 正己烷:分析纯
四、操作步骤
1、样品处理
鱼去鳞、去皮沿背脊取肌肉;虾去头、去壳取可食肌肉部分;蟹、甲鱼等取可食部分;样品切为0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后混匀。
称取5g精确到0.001g样品,置于50mL离心管中,加入1%高氯酸溶液10ml,用均质器均质30s,于振荡器上振荡提取3min,以4000r/min离心10min,取上层清夜于50mL试管中,向离心管中的残渣再加入0.5%的高氯酸溶液5mL,重复操作一次,合并上清液。加入1mL正己烷,振荡1min后离心,除去正己烷相,再加入1mL正己烷,重复操作一次。
用5mL甲醇、2mL5%乙二胺四乙酸二钠溶液、5mL水活化ODS-C18柱。接着将上述水相清液上样。用10mL蒸馏水洗去杂质,以5mL甲醇洗脱,收集洗脱液,40℃水浴中氮气吹干,以甲醇定容至1mL,以0.45μm滤膜过滤。滤液备用。
2、色谱参考条件
2. 1.色谱柱:ODS-C18
2. 2.柱温:37℃
2. 3.检测器:紫外检测器,检测波长:350nm
2. 4.流动相:乙腈-磷酸二氢钠溶液22:78
2. 5.流速:1mL/min
2. 6.进样量:20μL
3、工作曲线
在上述工作条件下,分别吸取混合标准使用液各20μL进样,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,绘制工作曲线。色谱图如下,出峰顺序依次为土霉素、四环素和金霉素。
4、样品测定
取样品滤液20μL进样,记录峰面积,从工作曲线算得土霉素、四环素、金霉素的含量。
5、结果计算
样品中土霉素、四环素、金霉素的含量按下式进行计算:
X=c×V/m
式中:
X——样品中抗生素的含量,单位为毫克每千克mg/kg;
c——样品溶液中抗生素含量,单位为微克每毫升μg/mL;
m——样品的质量,单位为克g;
V——样品溶液体积,单位为毫升mL;
计算结果保留两位有效数字。
6、方法回收率
本方法的回收率≥70%。
7、方法检测限
本方法的检测限:土霉素≤0.05mg/kg,四环素≤0.05mg/kg,金霉素≤0.1mg/kg。出峰顺序依次为土霉素、四环素和金霉素。