梯度优化是液相色谱方法开发中非常重要的一个环节，有时一个合适的梯度洗脱程序对液相色谱分析分离起到四两拨千斤的作用。

一、建立梯度方法的原因

为什么要用梯度的方式来洗脱呢？混合样品组分中，必定存在容易分离和不易分离的组分，保留较弱和保留较强的组分。我们建立梯度洗脱程序的目的就在于，将容易分离的组分在洗脱能力较弱的流动相中实现尽快分离，而保留较强的组分在色谱柱内停留较长时间，与键合相表面发生充分的相互作用，尽可能地彼此拉开，最后用强洗脱能力的流动相洗脱出来，避免洗脱时间过长。

二、反相液相色谱体系流动相的洗脱能力

反相色谱中如何判断流动相的洗脱能力呢？在反相体系中，随着流动相的极性不断增加（水相的比例在不断增加），流动相整体的洗脱能力逐渐减弱，而保留时间则在逐渐延长。因此对于容易分离的组分，可尝试在流动相极性较大的环境下将其实现分离。

同时，为了提高整个样品混合组分的分离度，在整个梯度程序内，也尽可能使用高比例的水相作为梯度洗脱的起始条件。因此进行一个全新项目的反相条件方法开发的时候，最常用的初始梯度模式便是在0~40min内，进行一个95%水相有机相的线性洗脱。

三、反相液相色谱梯度优化中心思路

反相色谱梯度优化的中心思路，其实就是尽可能减弱流动相的洗脱能力，从而减少共洗脱的情况。减弱流动相洗脱能力最有效的方式是更换洗脱强度弱一些的溶剂，或者增减流动相中的添加剂。

然而很多情况下是参照既定标准进行实验，溶剂种类和添加剂的量不便进行过多的调整，这样的情况下，还有一个方法可以调节流动相的洗脱强度，那就是减缓流动相的变化斜率。

在进行方法开发梯度优化的时候，一定要注意兼容性的问题，包括流动相溶剂彼此之间的兼容性，以及流动相和样品的兼容性。流动相溶剂选择上，选择能够任意比例互溶的溶剂。若是流动相溶剂不方便更换，则需尽量减缓流动相的变化速率，给有机相和水相（盐相）更多的时间来互溶。对于样品来说，流动相的性质一定要注意与样品溶剂能够兼容，避免出现在进样后的任意时刻样品不溶解、析出的情况。

（内容参考仪器信息网）